Plásmido CRISPR de Activación (m) IP3R-II: sc-421193-ACT

El gen murino *Itpr2* codifica el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato tipo 2 (IP3R-II), un canal de liberación de Ca²⁺ del retículo endoplásmico que convierte señales de IP3 en transitorios de calcio citosólico. IP3R-II actúa aguas abajo de vías de GPCR y de receptores tirosina cinasa que estimulan la fosfolipasa C, modulando procesos dependientes de Ca²⁺ como la secreción, la contracción, el metabolismo y las respuestas transcripcionales. Al regular la dinámica espaciotemporal del Ca²⁺ y la homeostasis de Ca²⁺ del RE, *Itpr2* influye en la señalización entre orgánulos y en respuestas al estrés que con frecuencia se ven alteradas en la fisiopatología. La desregulación de la señalización de calcio mediada por IP3R se ha implicado en diversos mecanismos relevantes para la enfermedad, incluidos cambios en la excitabilidad, defectos en el transporte epitelial y alteraciones de la homeostasis celular en contextos neurológicos y endocrinos.

IP3R-II El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Itpr2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

IP3R-II El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Itpr2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Itpr2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de IP3R-II. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Itpr2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de IP3R-II en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía IP3R-II en células tumorales con expresión de Itpr2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.