Particules Lentivirales d'Activation (h) INPP5E: sc-405923-LAC

INPP5E code l’inositol polyphosphate-5-phosphatase E, une 5‑phosphatase des phosphoinositides qui hydrolyse PI(4,5)P2 et PI(3,4,5)P3 afin de façonner la composition en phosphoinositides des membranes. INPP5E est enrichie au niveau du cil primaire et contribue à l’identité de la membrane ciliaire, au trafic et à la signalisation, notamment via la modulation de la sortie de la voie Hedgehog et, plus largement, de la dynamique de signalisation lipidique liée à PI3K–AKT. En contrôlant les gradients de phosphoinositides, INPP5E aide à coordonner la ciliogenèse, la localisation des récepteurs et les réponses en aval des seconds messagers. Une altération de la fonction d’INPP5E est associée à des phénotypes de ciliopathie et à des troubles du neurodéveloppement, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la signalisation dépendante des cils et de la régulation des lipides membranaires.

Les particules d'activation lentivirales INPP5E (h) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de INPP5E dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales INPP5E (h) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription INPP5E, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de INPP5E. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif INPP5E ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.