Plasmide CRISPR d'Activation (m) Ini1: sc-423027-ACT

Le gène murin Smarcb1 code Ini1 (également appelé SNF5/BAF47), une sous-unité centrale du complexe SWI/SNF (BAF) de remodelage de la chromatine dépendant de l’ATP, qui régule le positionnement des nucléosomes et des programmes transcriptionnels contrôlant la progression du cycle cellulaire, la spécification de lignée et la différenciation. Ini1 contribue à coordonner l’accessibilité des enhancers et des promoteurs, en intégrant les signaux de signalisation à l’état de la chromatine afin de moduler des réseaux d’expression génique impliqués dans le développement et les réponses aux dommages de l’ADN. La perturbation de la fonction de SMARCB1/INI1 est associée à une régulation épigénétique altérée et à une prolifération aberrante, et la perte de sous-unités de SWI/SNF constitue une caractéristique récurrente dans de nombreux types de tumeurs. En tant que régulateur central de la chromatine, Smarcb1 est fréquemment étudié dans des voies gouvernant l’équilibre entre répression et activation transcriptionnelles, le contrôle des points de contrôle (checkpoints) et l’architecture de la chromatine.

Ini1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Smarcb1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ini1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Smarcb1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Smarcb1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ini1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Smarcb1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ini1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ini1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Smarcb1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.