Plasmide CRISPR d'Activation (m) HuR/ELAV1: sc-421003-ACT

Elavl1 code pour HuR/ELAV1, une protéine de liaison à l’ARN qui reconnaît des éléments riches en AU dans les régions 3′ UTR et module la stabilité, la localisation et la traduction des ARNm. Dans les cellules de souris, HuR coordonne des programmes de régulation génique post‑transcriptionnelle liés au contrôle du cycle cellulaire, aux réponses au stress, à la signalisation de l’immunité innée et à la différenciation, en modulant la demi‑vie des transcrits de cytokines, de facteurs de croissance et de gènes associés à la survie cellulaire. L’activité de HuR est régulée de manière dynamique par phosphorylation et par navette nucléo‑cytoplasmique, intégrant des signaux issus des voies MAPK, PKC et d’autres voies afin d’ajuster finement les niveaux d’expression génique. Des régulons d’ARN dépendants de HuR dérégulés ont été associés dans la littérature à l’inflammation, à la transformation oncogénique et au remodelage tissulaire, faisant d’Elavl1 un nœud utile pour des études mécanistiques du métabolisme de l’ARN et des interactions entre voies de signalisation.

HuR/ELAV1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Elavl1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HuR/ELAV1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Elavl1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Elavl1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HuR/ELAV1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Elavl1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HuR/ELAV1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HuR/ELAV1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Elavl1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.