Plasmide CRISPR d'Activation (h) Huntingtin: sc-401441-ACT

HTT code la huntingtine, une grande protéine cytoplasmique et nucléaire qui contribue à l’homéostasie neuronale grâce à ses rôles dans le trafic vésiculaire, l’endocytose, l’autophagie et le transport dépendant des microtubules. La huntingtine influence également la régulation transcriptionnelle et la fonction synaptique en coordonnant des réseaux d’interactions protéine–protéine et en servant d’échafaudage à des complexes de signalisation. Dans les cellules humaines, HTT participe aux voies de réponse au stress et de protéostasie, reliant la fonction mitochondriale et l’élimination sélective de cargaisons aux programmes cellulaires de survie. La dérégulation de la biologie de la huntingtine, notamment l’altération de la protéostasie et du contrôle transcriptionnel, est largement utilisée comme modèle pour étudier les perturbations de voies associées à la neurodégénérescence.

Huntingtin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HTT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Huntingtin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HTT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HTT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Huntingtin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HTT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Huntingtin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Huntingtin dans les cellules tumorales présentant une expression de HTT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.