Plasmide CRISPR d'Activation (h) HtrA: sc-403306-ACT

HTRA1 humain code la protéase à sérine sécrétée HtrA1, un régulateur de la protéostasie de la matrice extracellulaire (MEC) qui clive de multiples substrats matriciels et associés à la signalisation. L’activité de HtrA1 influence le remodelage tissulaire et les interactions cellule–matrice, et elle module des voies de signalisation de facteurs de croissance, notamment TGF-β, en modifiant la disponibilité et le processing des composants de la voie dans l’environnement péricellulaire. Une expression ou une fonction dérégulée de HTRA1 a été associée à des pathologies vasculaires et du tissu conjonctif, à la dégénérescence maculaire liée à l’âge et au remodelage du microenvironnement tumoral, ce qui en fait un nœud utile pour étudier la signalisation pilotée par la MEC et les réponses au stress.

HtrA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HTRA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HtrA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HTRA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HTRA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HtrA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HTRA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HtrA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HtrA dans les cellules tumorales présentant une expression de HTRA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.