Plasmide CRISPR d'Activation (h) HSPA8/HSC70: sc-418508-ACT

HSPA8 code la protéine apparentée aux protéines de choc thermique de 71 kDa (HSC70), un chaperon constitutivement exprimé de la famille HSP70 qui maintient la protéostasie en assurant, de façon ATP‑dépendante, le repliement, le repliement correct et le trafic de protéines clientes. HSC70 participe à l’endocytose médiée par la clathrine, à l’autophagie médiée par les chaperons via la reconnaissance de LAMP2A, ainsi qu’aux voies de contrôle qualité des protéines liées au système ubiquitine–protéasome et à la dynamique des granules de stress. En régulant la prise en charge des polypeptides naissants, l’import des protéines dans les organites et les réseaux chaperon–cochaperon, HSPA8 influence la survie cellulaire en conditions de stress protéotoxique et métabolique. La dérégulation de la protéostasie centrée sur HSC70 est impliquée dans la neurodégénérescence, l’adaptation des cellules cancéreuses au stress et la biologie des infections virales, faisant de HSPA8 un nœud utile pour des études mécanistiques des voies de stress et de trafic intracellulaire.

HSPA8/HSC70 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HSPA8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HSPA8/HSC70 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HSPA8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HSPA8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HSPA8/HSC70. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HSPA8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HSPA8/HSC70 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HSPA8/HSC70 dans les cellules tumorales présentant une expression de HSPA8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.