Plasmide CRISPR d'Activation (h) HSP70-2: sc-417733-ACT

HSPA1B code pour la chaperonne inductible HSP70-2, un composant central de la réponse cellulaire au choc thermique qui maintient la protéostasie lors de stress protéotoxiques. HSP70-2 se lie aux régions hydrophobes exposées des protéines naissantes ou mal repliées afin de favoriser leur repliement, d’empêcher leur agrégation et de faciliter les décisions d’aiguillage entre repliement et dégradation via le système ubiquitine–protéasome et l’autophagie. En coordination avec des co-chaperonnes et la signalisation des facteurs de choc thermique, HSP70-2 influence l’apoptose, la signalisation inflammatoire et le rétablissement après des stress oxydants, thermiques et associés au réticulum endoplasmique. Des altérations de l’activité du réseau HSP70 ont été associées à des phénotypes pertinents pour la survie des cellules tumorales, la neurodégénérescence et la cytotoxicité induite par le stress, faisant de HSPA1B un nœud utile pour des études mécanistiques de l’adaptation au stress.

HSP70-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HSPA1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HSP70-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HSPA1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HSPA1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HSP70-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HSPA1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HSP70-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HSP70-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de HSPA1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.