Plásmido CRISPR de Activación (h) HSP 40-4: sc-403819-ACT

DNAJA1 codifica la cochaperona humana HSP 40-4 (homóloga de Hsp40/DnaJ), una proteína con dominio J que estimula la actividad ATPasa de HSPA/Hsp70 para favorecer el plegamiento, el replegamiento y la clasificación de proteínas cliente durante el estrés de proteostasis. Al coordinarse con Hsp70 y otras redes de chaperonas, HSP 40-4 contribuye al control de calidad proteico, al manejo de proteínas mal plegadas y a las respuestas celulares al choque térmico y al estrés oxidativo, con vínculos funcionales con las vías de ubiquitina–proteasoma y de autofagia. La alteración de la capacidad de chaperonas y el desequilibrio de la proteostasis se han implicado en la tolerancia al estrés de células cancerosas y en patologías por mal plegamiento proteico, lo que convierte a DNAJA1 en un nodo útil para investigar mecanismos de adaptación al estrés y la regulación de proteínas de señalización dependiente de chaperonas.

HSP 40-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DNAJA1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HSP 40-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DNAJA1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DNAJA1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HSP 40-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DNAJA1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HSP 40-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HSP 40-4 en células tumorales con expresión de DNAJA1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.