Plasmide CRISPR d'Activation (h) Homer-2a/b: sc-402910-ACT

HOMER2 code pour la protéine d’échafaudage Homer‑2a/b, un composant de la densité postsynaptique qui couple les récepteurs métabotropes du glutamate de groupe I à des effecteurs intracellulaires, notamment les récepteurs de l’IP3, les complexes Shank et les canaux TRPC. En organisant des assemblages récepteur–effecteur, Homer‑2a/b régule la signalisation du Ca2+, la plasticité synaptique, des programmes transcriptionnels dépendants de l’activité et le remodelage du cytosquelette dans les cellules excitables. La signalisation dépendante de HOMER2 a été impliquée dans le fonctionnement des circuits neuronaux et la neuroadaptation, et une expression altérée ou une connectivité de réseau modifiée des protéines d’échafaudage de la famille HOMER est associée à des phénotypes neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux. En plus des contextes du SNC, HOMER2 contribue à l’architecture plus large de la signalisation des GPCR, ce qui le rend pertinent pour l’étude du couplage stimulus–réponse et de la dynamique des complexes protéiques.

Homer-2a/b Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HOMER2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Homer-2a/b Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HOMER2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HOMER2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Homer-2a/b. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HOMER2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Homer-2a/b au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Homer-2a/b dans les cellules tumorales présentant une expression de HOMER2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.