Plasmide CRISPR d'Activation (m) Homer-1: sc-424092-ACT

Le gène murin Homer1 code Homer-1, une protéine d’échafaudage de la densité postsynaptique qui organise les récepteurs métabotropes du glutamate de groupe I et leurs effecteurs associés afin de coordonner la signalisation calcique, la plasticité synaptique et les programmes géniques dépendants de l’activité. Grâce à ses interactions médiées par le domaine EVH1, Homer-1 couple mGluR1/5 à la libération de calcium dépendante du récepteur à l’IP3 et interagit avec Shank et d’autres composants de la PSD pour façonner l’architecture des synapses excitatrices. Des altérations de la signalisation de HOMER1 ont été associées à une neurotransmission glutamatergique dérégulée et à un remodelage des circuits dans des contextes de maladies neuropsychiatriques et neurodégénératives, notamment des phénotypes liés au stress et une susceptibilité accrue aux crises. En tant qu’isoforme de gène à réponse immédiate et échafaudage de forme longue, Homer-1 constitue un nœud expérimentalement accessible pour étudier l’adaptation synaptique dépendante des stimuli et le trafic des récepteurs.

Homer-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Homer1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Homer-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Homer1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Homer1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Homer-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Homer1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Homer-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Homer-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Homer1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.