Plasmide CRISPR d'Activation (m) hnRNP I: sc-422470-ACT

Le gène murin Ptbp1 code la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène I (hnRNP I/PTBP1), une protéine liant l’ARN qui régule l’épissage alternatif des pré-ARNm, la maturation de l’extrémité 3′, la stabilité des ARNm et la traduction dépendante des sites d’entrée interne du ribosome (IRES). hnRNP I façonne des programmes transcriptionnels spécifiques des tissus et influence les transitions d’état cellulaire en contrôlant le choix des exons au sein de réseaux liés à la différenciation neuronale, à la prolifération et à l’adaptation métabolique. Grâce à un contrôle coordonné de la maturation des ARN et de la traduction, PTBP1 s’articule avec des voies qui gouvernent le remodelage du cytosquelette et l’expression de gènes sensibles au stress. Une activité dérégulée de PTBP1 a été associée à des modifications des profils d’épissage de l’ARN pertinentes pour des phénotypes neurodéveloppementaux et pour le remodelage oncogénique des programmes d’expression génique, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques du traitement des ARN.

hnRNP I Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ptbp1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

hnRNP I Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ptbp1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ptbp1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de hnRNP I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ptbp1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de hnRNP I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie hnRNP I dans les cellules tumorales présentant une expression de Ptbp1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.