Plasmide CRISPR d'Activation (h) hnRNP H3: sc-404805-ACT

HNRNPH3 code la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène humaine H3 (hnRNP H3), une protéine liant l’ARN qui s’associe aux transcrits naissants et régule le traitement du pré-ARNm. hnRNP H3 contribue au choix des sites d’épissage et aux programmes d’épissage alternatif grâce à la reconnaissance d’éléments d’ARN riches en G, influençant l’équilibre des isoformes de transcrits, la maturation de l’ARN et les réseaux d’expression génique en aval. En tant que composant d’assemblages ribonucléoprotéiques liés au traitement co‑transcriptionnel de l’ARN, elle s’interface avec des voies qui régissent l’export de l’ARNm, sa stabilité et son aptitude à être traduit. La dérégulation des facteurs d’épissage de la famille hnRNP est fréquemment étudiée dans le contexte d’une utilisation aberrante des isoformes observée dans divers cancers et modèles de maladies neurologiques, ce qui rend HNRNPH3 pertinent pour l’étude de phénotypes induits par des altérations du traitement de l’ARN.

hnRNP H3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HNRNPH3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

hnRNP H3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HNRNPH3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HNRNPH3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de hnRNP H3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HNRNPH3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de hnRNP H3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie hnRNP H3 dans les cellules tumorales présentant une expression de HNRNPH3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.