Plasmide CRISPR d'Activation (h) HLF: sc-404752-ACT

Le gène humain HLF (hepatic leukemia factor) code un facteur de transcription PAR bZIP qui se lie à des éléments régulateurs de l’ADN afin de contrôler des programmes géniques impliqués dans la différenciation cellulaire, la transcription associée aux rythmes circadiens et l’expression de gènes répondant au stress. HLF participe à des réseaux transcriptionnels qui façonnent l’identité des lignées hématopoïétiques et le calendrier du développement, avec des effets en aval sur le contrôle du cycle cellulaire et les voies de survie. Une expression dérégulée de HLF a été associée à des états hématopoïétiques altérés et à une reprogrammation transcriptionnelle oncogénique dans des contextes pertinents pour la leucémie, ce qui en fait un nœud utile pour étudier des phénotypes pilotés par des facteurs de transcription. En tant que régulateur nucléaire, HLF est couramment étudié pour son impact sur l’activité des promoteurs/activateurs (enhancers), les circuits de régulation génique et la plasticité transcriptionnelle spécifique des lignées.

HLF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HLF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HLF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HLF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HLF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HLF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HLF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HLF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HLF dans les cellules tumorales présentant une expression de HLF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.