HIRA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404262-ACT

A HIRA humana codifica uma chaperona de histonas que atua em parceria com ASF1A/ASF1B para depositar a variante de histona H3.3 de maneira independente da replicação do DNA, modulando a acessibilidade da cromatina e estados transcricionais de longo prazo. A incorporação de H3.3 dependente de HIRA sustenta a estabilidade do genoma, as respostas ao estresse de replicação, a remodelação da cromatina associada à senescência e a regulação adequada de programas gênicos do desenvolvimento e do ciclo celular. Ao influenciar a montagem de nucleossomos em promotores, enhancers e em sítios de dano ao DNA, a HIRA conecta a manutenção epigenética a vias que controlam diferenciação, proliferação e envelhecimento celular. A desregulação da função ou da expressão de HIRA tem sido associada à organização aberrante da cromatina e a programas transcricionais observados em contextos de biologia do câncer e do neurodesenvolvimento, tornando-a um ponto útil para estudos mecanísticos em epigenética.

HIRA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HIRA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HIRA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HIRA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HIRA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HIRA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HIRA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HIRA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HIRA em células tumorais com expressão de HIRA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.