Plasmide CRISPR d'Activation (h) HIP12: sc-405552-ACT

HIP1R humain code la huntingtin interacting protein 1 related (HIP12), un adaptateur endocytaire qui relie les puits tapissés de clathrine au cytosquelette d’actine et participe à l’internalisation des récepteurs ainsi qu’au trafic membranaire. HIP12 contient des domaines se liant à la clathrine et à la F-actine, ce qui favorise la formation de vésicules, le tri du cargo et la coordination de la dynamique du cytosquelette. Grâce à ces fonctions, HIP12 contribue à des voies qui régulent l’endocytose, l’atténuation de la signalisation cellulaire et des événements de remodelage dépendants du cytosquelette. Une régulation altérée d’adaptateurs endocytaires tels que HIP1R a été associée dans la littérature à des perturbations des réseaux de signalisation et de l’homéostasie cellulaire pertinentes pour la neurobiologie et des phénotypes liés au cancer, faisant de HIP12 une cible utile pour des études mécanistiques.

HIP12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HIP1R sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HIP12 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HIP1R dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HIP1R, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HIP12. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HIP1R natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HIP12 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HIP12 dans les cellules tumorales présentant une expression de HIP1R silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.