Plasmide CRISPR d'Activation (h2) HEATR5B: sc-412293-ACT-2

Le gène humain HEATR5B code une protéine contenant des répétitions HEAT, dont la fonction présumée est celle d’un facteur d’échafaudage organisant des assemblages multiprotéiques et soutenant le trafic intracellulaire ainsi que des processus liés au cytosquelette. Compte tenu des rôles connus des protéines à répétitions HEAT, HEATR5B devrait moduler le transport nucléocytoplasmique, la dynamique des complexes protéiques et la régulation de l’expression génique en réponse au stress, avec des effets en aval sur les voies de croissance et de différenciation cellulaires. Une activité ou une expression altérée de HEATR5B pourrait contribuer à des mécanismes pathogènes impliquant une perturbation de l’homéostasie des transports et une signalisation aberrante, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des dysfonctions cellulaires complexes dans les maladies humaines. L’édition génomique de HEATR5B est utile pour générer des modèles cellulaires knockout ou étiquetés afin de cartographier les interactomes, de définir la localisation subcellulaire et d’examiner des phénotypes au niveau des voies à l’aide de lectures transcriptomiques et protéomiques.

HEATR5B Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HEATR5B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HEATR5B Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HEATR5B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HEATR5B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HEATR5B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HEATR5B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HEATR5B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HEATR5B dans les cellules tumorales présentant une expression de HEATR5B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.