Plasmide CRISPR d'Activation (m) HE4: sc-426693-ACT

La souris Wfdc2 code HE4, une glycoprotéine sécrétée contenant un domaine de type « whey acidic protein » (WAP), impliquée dans la régulation des protéases extracellulaires et l’homéostasie des cellules épithéliales. HE4 est associée au remodelage de la matrice péricellulaire et à la modulation des signaux inflammatoires, des processus qui influencent l’architecture tissulaire, la fonction barrière et la communication entre cellules. Dans des systèmes expérimentaux, une expression altérée de HE4 est associée à des changements des programmes de prolifération, de migration et de différenciation au sein des compartiments épithéliaux. Ces caractéristiques font de Wfdc2 un outil moléculaire utile pour étudier la protéostasie à la surface cellulaire et les interactions entre facteurs sécrétés et réponses transcriptionnelles intracellulaires.

HE4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Wfdc2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HE4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Wfdc2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Wfdc2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HE4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Wfdc2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HE4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HE4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Wfdc2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.