HE4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-426693-ACT

Mouse Wfdc2 kodiert HE4, ein sezerniertes Glykoprotein mit einer whey-acidic-protein-(WAP-)Domäne, das an der Regulation extrazellulärer Proteasen und der Homöostase epithelialer Zellen beteiligt ist. HE4 wird mit dem Umbau der perizellulären Matrix und der Modulation entzündlicher Signalwege in Verbindung gebracht – Prozesse, die Gewebearchitektur, Barrierefunktion und Zell-Zell-Kommunikation beeinflussen. In experimentellen Systemen ist eine veränderte HE4-Expression mit Änderungen in Proliferations-, Migrations- und Differenzierungsprogrammen in epithelialen Kompartimenten assoziiert. Diese Eigenschaften machen Wfdc2 zu einem nützlichen molekularen Ansatzpunkt, um Proteostase an der Zelloberfläche sowie das Crosstalk zwischen sezernierten Faktoren und intrazellulären transkriptionellen Antworten zu untersuchen.

HE4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Wfdc2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HE4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Wfdc2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Wfdc2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HE4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Wfdc2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HE4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HE4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Wfdc2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.