Plasmide CRISPR d'Activation (h) HE4: sc-402876-ACT

WFDC2 code pour HE4 (human epididymis protein 4), une glycoprotéine sécrétée contenant un domaine WAP (whey acidic protein), impliquée dans la régulation des protéases extracellulaires et le remodelage du microenvironnement péricellulaire. L’expression de HE4 est associée à des programmes de différenciation épithéliale et peut influencer les interactions cellule–cellule, l’adhésion et la protéostase au sein de la voie de sécrétion et de l’espace extracellulaire. Des niveaux dérégulés de WFDC2/HE4 ont été associés à une altération de l’homéostasie tissulaire et à des contextes de signalisation inflammatoire dans plusieurs cadres pathologiques issus de tissus épithéliaux. En tant que protéine circulante et associée aux tumeurs dans plusieurs profils d’expression liés aux cancers, HE4 est fréquemment utilisée comme indicateur moléculaire de l’activation de voies et pour la stratification des phénotypes en recherche translationnelle.

HE4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de WFDC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HE4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus WFDC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription WFDC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HE4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus WFDC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HE4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HE4 dans les cellules tumorales présentant une expression de WFDC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.