Plasmide CRISPR d'Activation (h) Hck: sc-401507-ACT

Le gène humain **HCK** code Hck, une tyrosine kinase non réceptrice de la famille Src, exprimée principalement dans les lignées myéloïdes, où elle couple les signaux des immunorécepteurs et des intégrines à des cascades de phosphorylation en aval. Hck régule le remodelage du cytosquelette, l’adhésion, la chimiotaxie, la phagocytose et la production de médiateurs inflammatoires via des voies qui recoupent les signalisations PI3K–AKT, MAPK/ERK et STAT. Dans les contextes hématopoïétiques et immunitaires, une activité dérégulée de Hck a été associée à une altération des réponses immunitaires innées et à des réseaux de signalisation aberrants observés dans les leucémies et d’autres pathologies liées à l’inflammation. En tant que kinase proximale dans la signalisation déclenchée par les récepteurs, HCK est fréquemment étudié pour disséquer les programmes de phosphorylation dépendants du stimulus et les mécanismes de rétrocontrôle dans les cellules myéloïdes.

Hck Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HCK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Hck Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HCK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HCK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Hck. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HCK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Hck au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Hck dans les cellules tumorales présentant une expression de HCK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.