Plasmide CRISPR d'Activation (m) HAX-1: sc-423888-ACT

Le gène murin Hax1 code HAX-1, une protéine principalement associée aux mitochondries et au réticulum endoplasmique, qui régule la survie cellulaire en modulant l’apoptose, l’homéostasie du calcium et les réponses au stress. HAX-1 a été impliquée dans le contrôle de l’intégrité de la membrane mitochondriale et dans l’intégration de voies de signalisation qui influencent la fonction des leucocytes et, plus largement, l’homéostasie immunitaire. Par ses interactions avec des composants du cytosquelette et de la machinerie de trafic vésiculaire, HAX-1 peut également affecter la migration cellulaire et le transport intracellulaire. La dérégulation des programmes de survie dépendants de HAX-1 est pertinente dans des modèles de dysfonctionnement hématopoïétique et d’inflammation, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques des voies d’adaptation au stress.

HAX-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hax1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HAX-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hax1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hax1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HAX-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hax1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HAX-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HAX-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Hax1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.