Plasmide CRISPR d'Activation (h) HAI-1: sc-404011-ACT

SPINT1 code l’inhibiteur‑1 de l’activateur du facteur de croissance des hépatocytes (HAI‑1), un inhibiteur de sérine‑protéases de type Kunitz associé à la membrane, qui limite la protéolyse péricellulaire en inhibant des protéases telles que HGFA et la matriptase (ST14). En régulant l’activation de HGF et la signalisation en aval via la voie MET, HAI‑1 influence l’homéostasie épithéliale, l’intégrité des jonctions intercellulaires et le remodelage de la matrice extracellulaire. Les réseaux SPINT1–protéases recoupent des processus tels que la différenciation épithéliale, la réparation des plaies et les cascades de protéases inflammatoires. Une expression dérégulée de HAI‑1 ou un déséquilibre avec ses protéases apparentées a été associé à une altération de la fonction de barrière épithéliale et à des phénotypes dépendants des protéases, rapportés dans de multiples contextes de recherche sur le cancer et les maladies fibrosantes.

HAI-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPINT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HAI-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPINT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPINT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HAI-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPINT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HAI-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HAI-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPINT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.