Plasmide CRISPR d'Activation (m) HACE1: sc-431639-ACT

La protéine murine HACE1 (HECT domain and ankyrin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase 1) code une ligase E3 de l’ubiquitine qui régule le renouvellement des protéines et la signalisation en catalysant le transfert d’ubiquitine vers des substrats spécifiques. HACE1 a été associée à l’organisation du cytosquelette, au trafic vésiculaire et aux voies de réponse au stress, et peut influencer des processus dépendants des petites GTPases qui façonnent la migration et l’adhésion cellulaires. En modulant le contrôle qualité dépendant de l’ubiquitine et l’amplitude des signaux, HACE1 soutient l’homéostasie cellulaire dans des contextes où la protéostasie et l’équilibre redox sont mis à l’épreuve. Une activité altérée de HACE1 a été associée à une dérégulation du contrôle de la croissance et à des phénotypes touchant la stabilité du génome, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de fonctions de type suppresseur de tumeur et de reprogrammation des voies dans des modèles de maladie.

HACE1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hace1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HACE1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hace1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hace1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HACE1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hace1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HACE1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HACE1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Hace1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.