Plasmide CRISPR d'Activation (h) H-Ras: sc-400204-ACT

HRAS code H-Ras, une petite GTPase associée à la membrane, qui alterne entre des états liés au GDP et au GTP afin de transmettre des signaux depuis des récepteurs à activité tyrosine kinase activés vers des voies effectrices en aval. H-Ras mobilise les voies de signalisation RAF–MEK–ERK et PI3K–AKT pour réguler la prolifération, la différenciation, la dynamique du cytosquelette et la survie, avec des rôles additionnels dans le trafic vésiculaire et la motilité cellulaire. Une activité dérégulée de HRAS perturbe les réseaux de signalisation mitogène et est impliquée dans la transformation oncogénique ainsi que dans des phénotypes développementaux de type RASopathies. En tant que nœud central de signalisation, H-Ras est largement utilisé pour étudier l’interconnexion des voies, le contrôle par rétroaction et des programmes transcriptionnels dépendants du contexte.

H-Ras Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HRAS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

H-Ras Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HRAS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HRAS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de H-Ras. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HRAS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de H-Ras au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie H-Ras dans les cellules tumorales présentant une expression de HRAS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.