h-prune CRISPR Activation Plasmid (h): sc-412914-ACT

PRUNE1 kodiert h-prune, eine Phosphoesterase der DHH-Familie, die am zyklischen Nukleotidstoffwechsel und an der Regulation der Zellmotilität beteiligt ist. h-prune interagiert mit Signal-Knotenpunkten, die das Umgestalten des Zytoskeletts, den Umsatz fokaler Adhäsionen sowie mit Proliferation und Migration verknüpfte Prozesse beeinflussen, einschließlich Crosstalk mit PI3K/AKT und verwandten Signalwegen. Eine veränderte PRUNE1-Aktivität wurde mit fehlregulierten Entwicklungs- und neurobiologischen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird in der Onkologie häufig im Kontext invasionsassoziierter zellulärer Programme untersucht. Daher dient PRUNE1 als nützliches Ziel, um Mechanismen der Migration, der metabolischen Signalübertragung und transkriptioneller Zustände zu analysieren, die krankheitsrelevante Zellverhaltensweisen prägen.

h-prune Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRUNE1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

h-prune Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRUNE1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRUNE1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen h-prune-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRUNE1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von h-prune-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des h-prune-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRUNE1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.