Plasmide CRISPR d'Activation (h) GTPBP4: sc-408845-ACT

Le gène humain **GTPBP4** code une NTPase nucléolaire de type P-loop qui s’associe à des particules pré‑ribosomiques et favorise la maturation de la grande sous-unité ribosomique 60S. Par ses rôles dans le traitement de l’ARNr et la biogenèse des ribosomes, GTPBP4 influence la capacité de traduction, la protéostase et la progression du cycle cellulaire en conditions de croissance comme de stress. La perturbation de la fonction nucléolaire et de l’assemblage des ribosomes est une caractéristique de multiples états prolifératifs et de réponse au stress, ce qui fait de GTPBP4 un nœud pertinent pour analyser les liens entre la surveillance nucléolaire, la signalisation associée à p53 et le contrôle global de la traduction. Une régulation anormale des facteurs de biogenèse des ribosomes, y compris des GTPases telles que GTPBP4, a été associée dans la littérature à des programmes oncogéniques et à des modifications de la fitness cellulaire, soulignant sa pertinence pour des études mécanistiques dans des modèles de maladie.

GTPBP4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GTPBP4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GTPBP4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GTPBP4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GTPBP4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GTPBP4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GTPBP4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GTPBP4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GTPBP4 dans les cellules tumorales présentant une expression de GTPBP4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.