Plasmide CRISPR d'Activation (m) G_{γ 10}: sc-420613-ACT

Gng10 code la sous-unité gamma 10 de la protéine G (Gγ10) chez la souris, un composant essentiel des protéines G hétérotrimériques qui relient les GPCR activés à des effecteurs en aval. En s’associant à des sous-unités Gα et Gβ spécifiques, Gγ10 contribue à contrôler la localisation membranaire et la sortie de signalisation, pouvant influencer l’activité de l’adénylate cyclase, la signalisation via la phospholipase C, la modulation des canaux ioniques, ainsi que des réponses en aval liées aux voies MAPK et PI3K. Ces voies régulent la communication cellulaire, la sécrétion, la motilité et des programmes transcriptionnels dépendants des stimuli dans de nombreux tissus. Des modifications de la dynamique de signalisation GPCR–protéines G sont largement pertinentes pour l’étude de la fonction neuronale, de la signalisation immunitaire et de la reprogrammation de la signalisation associée au cancer, ce qui fait de Gng10 une cible utile pour des expériences de perturbation de voie dans des systèmes modèles murins.

Gγ 10 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Gng10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gγ 10 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Gng10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Gng10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gγ 10. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Gng10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gγ 10 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gγ 10 dans les cellules tumorales présentant une expression de Gng10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.