Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{β 4}: sc-400820-ACT

GNB4 code pour la sous-unité bêta Gβ4 des protéines G hétérotrimériques humaines, un échafaudage central qui stabilise les sous-unités Gα et Gγ et relaie les signaux en aval des RCPG (récepteurs couplés aux protéines G) activés. En coordonnant l’engagement des effecteurs, Gβ4 contribue à moduler des voies de second messager telles que la signalisation cAMP/PKA et PLCβ–IP3/DAG–Ca²⁺, influençant des cascades de kinases, notamment MAPK/ERK. Ces processus régulent, selon le contexte, des effets sur la prolifération, la différenciation, la sécrétion et l’excitabilité neuronale. Des altérations de la dynamique de signalisation RCPG–protéines G impliquant GNB4 ont été étudiées en lien avec des phénotypes neurologiques et, plus largement, avec des dérégulations de signalisation pertinentes pour des états cellulaires associés à des maladies.

Gβ 4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNB4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gβ 4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNB4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNB4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gβ 4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNB4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gβ 4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gβ 4 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNB4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.