Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α z}: sc-402241-ACT

GNAZ code la sous-unité alpha Gαz d’une protéine G hétérotrimérique inhibitrice, un médiateur de signalisation de la famille Gi/o qui couple certains récepteurs couplés aux protéines G à l’inhibition de l’adénylate cyclase et à une diminution de l’AMPc intracellulaire. En régulant la dynamique des seconds messagers, Gαz influence la signalisation en aval de la PKA, la modulation des canaux ioniques et des programmes de phosphorylation qui façonnent l’excitabilité neuronale, la sécrétion et la désensibilisation des récepteurs. L’activité de GNAZ s’entrecroise avec des voies sensibles aux neurotransmetteurs et aux hormones, et une altération du couplage RCPG–protéine G a été impliquée dans des phénotypes neuropsychiatriques, la fonction plaquettaire et des anomalies de la signalisation endocrine. En tant que sous-unité Gα inhibitrice distincte et insensible à la toxine pertussique (PTX), Gαz constitue un nœud utile pour disséquer une signalisation inhibitrice spécifique des récepteurs, par comparaison avec les autres protéines Gi.

Gα z Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNAZ sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα z Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNAZ dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNAZ, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα z. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNAZ natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα z au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα z dans les cellules tumorales présentant une expression de GNAZ silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.