Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α t2} : sc-401528-ACT

GNAT2 code la sous-unité alpha de la transducine des cônes, une protéine G hétérotrimérique, Gαt2, médiateur clé de la phototransduction dans les photorécepteurs cônes de la rétine. Lors de l’activation des opsines par la lumière, Gαt2 active des effecteurs en aval afin de réguler la signalisation des nucléotides cycliques, ce qui entraîne une modulation de l’activité des canaux ioniques et la propagation du signal visuel. Cette voie intègre la signalisation des GPCR au métabolisme du cGMP ainsi qu’à des mécanismes d’adaptation rapide essentiels au fonctionnement des cônes. Une activité altérée de GNAT2 est associée à des phénotypes héréditaires de dysfonction rétinienne, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la signalisation spécifique des cônes et de la biologie des neurones sensoriels.

Gα t2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNAT2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα t2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNAT2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNAT2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα t2 . Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNAT2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα t2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα t2 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNAT2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.