G_{α q} Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420601-ACT

Gnaq codifica a subunidade alfa Gαq das proteínas G heterotriméricas, um transdutor-chave de sinais provenientes de muitos receptores acoplados à proteína G (GPCRs) para a ativação a jusante da fosfolipase Cβ. A hidrólise de PIP2 impulsionada por Gαq gera IP3 e DAG, promovendo a mobilização intracelular de Ca2+, a sinalização da proteína quinase C e efeitos mais amplos sobre programas transcricionais dependentes de MAPK/ERK. Em células e tecidos de camundongo, a atividade de Gαq ajuda a coordenar processos como contração do músculo liso, secreção e excitabilidade neuronal por meio de redes de sinalização GPCR–Ca2+. A desregulação da sinalização de GNAQ/Gαq tem sido associada na literatura a contextos de sinalização proliferativa e inflamatória anormais e é frequentemente estudada por seus papéis na regulação vascular e imunológica, bem como na interconexão com vias oncogênicas.

Gα q O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Gnaq sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gα q O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Gnaq em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Gnaq, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gα q. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Gnaq nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gα q no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gα q em células tumorais com expressão de Gnaq silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.