Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α 15}: sc-403266-ACT

GNA15 code pour la sous-unité alpha Gα15 des protéines G hétérotrimériques, membre de la famille Gq, qui couple divers récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) à l’activation de la phospholipase C-β. Cet axe de signalisation entraîne la production d’inositol trisphosphate et de diacylglycérol, la mobilisation du calcium et des programmes transcriptionnels dépendants de la protéine kinase C, qui façonnent l’activation des cellules immunitaires et hématopoïétiques. Gα15 est enrichie dans les lignées leucocytaires et peut élargir la spécificité de couplage des récepteurs, influençant la chimiotaxie, la libération de cytokines et l’expression de gènes sensibles au stress. Une signalisation RCPG–Gα15 dérégulée a été impliquée dans une signalisation inflammatoire aberrante ainsi que dans une activité modifiée des voies des facteurs de croissance et de la MAPK, dans des contextes cellulaires pertinents pour la maladie.

Gα 15 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNA15 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα 15 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNA15 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNA15, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα 15. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNA15 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα 15 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα 15 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNA15 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.