Plasmide CRISPR d'Activation (h) G_{α 14}: sc-404556-ACT

GNA14 code pour la sous-unité alpha Gα14 des protéines G hétérotrimériques humaines, membre de la famille Gq/11, qui couple les GPCR activés à la signalisation via la phospholipase C-β. Lors de l’activation du récepteur, Gα14 favorise l’hydrolyse du PIP2 pour générer l’IP3 et le DAG, entraînant la mobilisation du Ca2+ intracellulaire, l’activation de la protéine kinase C et des programmes transcriptionnels en aval liés à la sécrétion, à la contraction du muscle lisse et à la signalisation des cellules immunitaires. Cet axe croise également les voies MAPK et des GTPases Rho, qui coordonnent la prolifération, le remodelage du cytosquelette et la migration cellulaire. Une signalisation GPCR–Gq dérégulée impliquant GNA14 a été associée à des états de signalisation altérés dans des contextes prolifératifs et inflammatoires, ce qui justifie son étude dans des modèles cellulaires pertinents pour les maladies.

Gα 14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNA14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gα 14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNA14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNA14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gα 14. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNA14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gα 14 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gα 14 dans les cellules tumorales présentant une expression de GNA14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.