GS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405996-ACT

Humanes PUDP (Pseudouridin-5′-Phosphatase), auch als GS1 bezeichnet, ist ein zytosolisches Enzym im Pyrimidin-Salvage-Netzwerk, das Pseudouridin-5′-monophosphat zu Pseudouridin dephosphoryliert und damit den Umsatz sowie das Recycling modifizierter Nukleoside aus dem RNA-Katabolismus unterstützt. Durch die Regulation der Spiegel von Pseudouridin-Nukleotiden beeinflusst PUDP die Nukleotidhomöostase und greift in Signal- und Stoffwechselwege ein, die die Dynamik von RNA-Modifikationen, den Ribonukleotidstoffwechsel und zelluläre Antworten auf metabolischen Stress steuern. Eine veränderte Verarbeitung modifizierter Nukleoside wird zunehmend mit einer fehlregulierten RNA-Turnover-Kontrolle und metabolischer Reprogrammierung in unterschiedlichsten Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, wodurch PUDP einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien darstellt. Die Modulation der PUDP/GS1-Expression ermöglicht es, zu untersuchen, wie der Pseudouridin-Stoffwechsel Genexpressionsprogramme und die Zellphysiologie beeinflusst.

GS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PUDP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PUDP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PUDP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PUDP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PUDP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.