Plasmide CRISPR d'Activation (h) GRPR: sc-401637-ACT

Le GRPR humain code le récepteur du peptide libérant la gastrine, un GPCR à sept domaines transmembranaires qui se lie au peptide libérant la gastrine et à des ligands apparentés de type bombésine afin de réguler la signalisation neuroendocrine. L’activation de GRPR recrute des protéines G hétérotrimériques pour stimuler le renouvellement des phosphoinositides dépendant de PLCβ, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire, ainsi que les voies de signalisation MAPK/ERK et PKC en aval, influençant la prolifération, la sécrétion et la contractilité du muscle lisse. Ce récepteur est largement pertinent pour les études du traitement sensoriel et de la physiologie gastro-intestinale, et une altération de la signalisation via GRPR a été associée à des phénotypes oncogéniques et neurocomportementaux dans plusieurs systèmes modèles. L’expression de GRPR et l’activité de sa voie sont fréquemment utilisées pour étudier des programmes transcriptionnels pilotés par des GPCR, la dynamique calcique et des biais de signalisation dépendants du ligand dans des cellules humaines.

GRPR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GRPR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRPR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GRPR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GRPR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRPR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GRPR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRPR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRPR dans les cellules tumorales présentant une expression de GRPR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.