Plasmide CRISPR d'Activation (h) GRASP65: sc-402436-ACT

Le gène humain **GORASP1** code **GRASP65**, une protéine périphérique des membranes localisée au **cis-Golgi** qui agit comme un organisateur majeur de l’architecture du ruban golgien. GRASP65 contribue à l’empilement des citernes golgiennes, à l’amarrage des vésicules et à la réassemblage des membranes du Golgi lors de l’entrée en mitose et de la sortie de mitose, en s’intégrant au trafic du réticulum endoplasmique vers le Golgi ainsi qu’au contrôle plus global de la voie sécrétoire. Par ses rôles dans l’organisation des organites et le traitement du cargo, GRASP65 influence le tri des protéines, la glycosylation et le transport polarisé, des processus centraux pour la progression du cycle cellulaire et les réponses au stress. La dérégulation de la structure du Golgi et des voies de trafic impliquant GRASP65 est liée à des phénotypes associés à des maladies, notamment en oncologie et dans les maladies neurodégénératives, où l’on observe fréquemment une sécrétion altérée et un remodelage des organites.

GRASP65 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GORASP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRASP65 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GORASP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GORASP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRASP65. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GORASP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRASP65 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRASP65 dans les cellules tumorales présentant une expression de GORASP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.