GPT2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403739-ACT

Humanes GPT2 (Glutamat-Pyruvat-Transaminase 2; mitochondriale Alanin-Aminotransferase) katalysiert die reversible Transaminierung zwischen Alanin und α‑Ketoglutarat, wobei Pyruvat und Glutamat entstehen, und verknüpft damit den Aminosäurestoffwechsel mit dem mitochondrialen Kohlenstofffluss. Durch die Unterstützung anaplerotischer Prozesse und des Glutamat-„Handlings“ trägt GPT2 zum Stickstoffgleichgewicht und zur Energiehomöostase bei und beeinflusst Signal- und Stoffwechselwege, die mit dem Citratzyklus (TCA-Zyklus) und dem Redoxzustand verbunden sind. Eine veränderte GPT2-Aktivität wurde im Kontext metabolischer Umprogrammierung und mitochondrialer Dysfunktion untersucht, wobei Verschiebungen in der Alanin–Pyruvat-Umwandlung die zelluläre Proliferation und Stressantworten beeinflussen können. Als mitochondriales Enzym ist GPT2 zudem relevant für Studien zur gewebespezifischen Stoffwechselregulation und zu Programmen der Nährstoffverwertung.

GPT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GPT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPT2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GPT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GPT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPT2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GPT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPT2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPT2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GPT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.