Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPRC5D: sc-403114-ACT

GPRC5D (récepteur couplé aux protéines G, classe C, groupe 5, membre D) code une protéine membranaire de type GPCR orpheline, enrichie dans les contextes épithéliaux et associée à une signalisation liée à la différenciation. En tant que membre d’une famille répondant à l’acide rétinoïque, GPRC5D est étudié pour ses liens avec des programmes transcriptionnels qui influencent l’état cellulaire, la signalisation des récepteurs membranaires et les interactions avec le microenvironnement. Des altérations de l’expression de GPRC5D ont été rapportées dans la recherche sur les hémopathies malignes, en particulier en biologie des plasmocytes, et le gène est également examiné dans des jeux de données portant sur les tumeurs solides et l’immuno-oncologie. Ces caractéristiques font de GPRC5D une cible utile pour étudier des réseaux régulateurs liés aux récepteurs et des phénotypes associés à des lignées cellulaires chez l’humain.

GPRC5D Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPRC5D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPRC5D Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPRC5D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPRC5D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPRC5D. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPRC5D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPRC5D au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPRC5D dans les cellules tumorales présentant une expression de GPRC5D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.