Plasmide CRISPR d'Activation (h) GPR54: sc-403766-ACT

KISS1R (GPR54) est un RCPG (récepteur couplé aux protéines G) de classe A qui se lie aux kisspeptines codées par KISS1 afin de réguler le contrôle neuroendocrinien du déclenchement de la puberté et le fonctionnement de l’axe reproducteur. Après liaison du ligand, GPR54 se couple principalement à Gαq/11 pour stimuler la signalisation de la phospholipase C, la mobilisation du calcium dépendante de l’IP3, ainsi que les voies MAPK/ERK et PKC en aval, qui influencent l’expression génique et l’excitabilité cellulaire. Ce nœud de signalisation est central pour l’activation des neurones hypothalamiques à GnRH et intègre des informations développementales, métaboliques et environnementales qui ajustent la libération des gonadotrophines. Des altérations de l’activité ou de l’expression de KISS1R ont été associées à des troubles du calendrier pubertaire et à l’hypogonadisme hypogonadotrope, et les perturbations de la voie GPR54 sont également étudiées dans le cadre de la biologie des tumeurs hormono‑dépendantes et des programmes de migration cellulaire.

GPR54 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KISS1R sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GPR54 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KISS1R dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KISS1R, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GPR54. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KISS1R natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GPR54 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GPR54 dans les cellules tumorales présentant une expression de KISS1R silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.