GPR105 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405954-ACT

P2RY14 kodiert den humanen purinergen Rezeptor GPR105, einen GPCR, der auf extrazelluläre UDP-Zucker wie UDP-Glukose reagiert und an die Gi/o-Signalübertragung koppelt, um intrazelluläres cAMP und nachgeschaltete Entzündungsprogramme zu modulieren. Die Aktivität von GPR105 beeinflusst die Chemotaxis von Leukozyten und die Zytokinproduktion und verknüpft damit die Erkennung von Nukleotid-Zuckern mit der Regulation der angeborenen Immunität in myeloiden und epithelialen Kompartimenten. Dieser Rezeptor greift in Chemokin- und purinerge Signalnetzwerke ein, die Gewebeentzündung sowie Barriereantworten prägen. Eine veränderte P2RY14/GPR105-Signalgebung wurde mit Immunfehlregulation und entzündungsassoziierter Pathophysiologie in Verbindung gebracht und ist damit relevant für mechanistische Studien zu mikroumgebungsgetriebenen Krankheitsprozessen.

GPR105 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen P2RY14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GPR105 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des P2RY14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der P2RY14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GPR105-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native P2RY14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GPR105-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GPR105-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem P2RY14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.