Plásmido CRISPR de Activación (m) GP49B: sc-420634-ACT

Lilrb4a de ratón codifica GP49B, un receptor inhibidor de la superfamilia de las inmunoglobulinas expresado predominantemente en células de la línea mieloide, incluidas los mastocitos y los macrófagos. GP49B contiene motivos ITIM citoplasmáticos que reclutan fosfatasas como SHP-1/2, atenuando las cascadas de señalización acopladas a receptores Fc e integrinas y limitando el flujo de calcio, la degranulación, la liberación de citocinas y la activación fagocítica. A través de la modulación de puntos de control de la inmunidad innata, Lilrb4a influye en el tono inflamatorio, la presentación de antígenos y los programas de remodelación tisular en compartimentos de barrera y hematopoyéticos. Por lo tanto, la señalización desregulada de GP49B es relevante para estudios mecanísticos de la homeostasis inmunitaria, la inflamación alérgica y la patología impulsada por células mieloides en modelos murinos.

GP49B El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Lilrb4a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

GP49B El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Lilrb4a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Lilrb4a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de GP49B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Lilrb4a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de GP49B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía GP49B en células tumorales con expresión de Lilrb4a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.