Plasmide CRISPR d'Activation (m) GP49B: sc-420634-ACT

Lilrb4a chez la souris code GP49B, un récepteur inhibiteur de la superfamille des immunoglobulines exprimé principalement par les cellules de la lignée myéloïde, notamment les mastocytes et les macrophages. GP49B possède des motifs ITIM cytoplasmiques qui recrutent des phosphatases telles que SHP-1/2, ce qui atténue les cascades de signalisation couplées aux récepteurs Fc et aux intégrines et limite le flux calcique, la dégranulation, la libération de cytokines et l’activation phagocytaire. En modulant des points de contrôle de l’immunité innée, Lilrb4a influence le tonus inflammatoire, la présentation de l’antigène et les programmes de remodelage tissulaire dans les compartiments barrières et hématopoïétiques. Une signalisation GP49B dérégulée est donc pertinente pour des études mécanistiques de l’homéostasie immunitaire, de l’inflammation allergique et des pathologies myéloïdes dans des modèles murins.

GP49B Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Lilrb4a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GP49B Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Lilrb4a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Lilrb4a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GP49B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Lilrb4a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GP49B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GP49B dans les cellules tumorales présentant une expression de Lilrb4a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.