Plasmide CRISPR d'Activation (h) GM130: sc-400787-ACT

GOLGA2 code la protéine matricielle du cis-Golgi GM130, un composant central du réseau des golgines qui maintient l’architecture du ruban golgien et coordonne l’amarrage et la fusion des vésicules. GM130 participe au trafic du réticulum endoplasmique (RE) vers le Golgi ainsi qu’au démantèlement et à la réassemblage du Golgi pendant la mitose, via des interactions avec des protéines telles que GRASP65 et la machinerie d’arrimage des vésicules, reliant la dynamique de la voie sécrétoire à la progression du cycle cellulaire. Une perturbation de l’organisation dépendante de GM130 peut modifier la glycosylation des protéines, le trafic membranaire et le positionnement des organites, des processus fréquemment impliqués dans l’invasion des cellules cancéreuses, la neurodégénérescence et des troubles congénitaux affectant la sécrétion.

GM130 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GOLGA2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GM130 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GOLGA2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GOLGA2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GM130. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GOLGA2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GM130 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GM130 dans les cellules tumorales présentant une expression de GOLGA2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.