Glyoxalase I CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401914-ACT

Humanes GLO1 kodiert für Glyoxalase I, ein zinkabhängiges Metalloenzym, das den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Glyoxalase-Systems katalysiert und dabei das zytotoxische glykolytische Nebenprodukt Methylglyoxal (als Hemithioacetal mit Glutathion) in S‑D‑Lactoylglutathion umwandelt. Durch die Kontrolle der Methylglyoxalspiegel trägt GLO1 dazu bei, die nichtenzymatische Glykierung von Proteinen und Nukleinsäuren zu begrenzen und die Bildung fortgeschrittener Glykationsendprodukte (AGEs) zu verringern, wodurch es die Redoxhomöostase und zelluläre Stressantworten beeinflusst. Die GLO1-Aktivität ist mit metabolischer Umprogrammierung und Entgiftungskapazität verknüpft – Prozesse, die häufig in Modellen für oxidativen Stress, Entzündung und veränderten Glukosestoffwechsel untersucht werden. Eine gestörte Methylglyoxal-Elimination und erhöhte Glykationslast sind für krankheitsassoziierte Phänotypen relevant, darunter Insulinresistenz, vaskuläre Dysfunktion und Stress-Toleranz von Tumorzellen, was GLO1 als funktionellen Knotenpunkt in der Forschung zu Stoffwechsel und Proteostase unterstützt.

Glyoxalase I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GLO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Glyoxalase I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GLO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GLO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Glyoxalase I-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GLO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Glyoxalase I-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Glyoxalase I-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GLO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.