Plasmide CRISPR/Cas9 KO Gl Syn (m): sc-420579

Présentation

Glul chez la souris code la glutamine synthétase (Gl Syn), une enzyme cytosolique qui catalyse la conversion, dépendante de l’ATP, du glutamate et de l’ammoniac en glutamine, contribuant ainsi au maintien de l’homéostasie de l’azote et à la détoxification de l’ammoniac. En contrôlant les réserves intracellulaires de glutamine, GLUL influence le métabolisme des acides aminés, la biosynthèse des nucléotides et l’équilibre rédox via le soutien à la production de glutathion, reliant ainsi la disponibilité en nutriments à la croissance cellulaire et aux réponses au stress. L’activité de Glul s’interface avec des voies telles que la signalisation mTORC1 et le métabolisme anaplérotiques en régulant les flux de carbone et d’azote dépendants de la glutamine. Une dérégulation du métabolisme de la glutamine et des modifications de l’expression de GLUL ont été associées à des états de stress métabolique et à la biologie tumorale, faisant de Glul une cible pertinente pour l’étude de l’adaptation aux nutriments et de la prolifération cellulaire.

Le Gl Syn CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) est un ensemble de plasmides conçus pour la disruption ciblée du gène Glul dans les lignées cellulaires mouse. Chaque plasmide du pool co-exprime un sgRNA unique, ciblant un site distinct au sein du locus Glul, ainsi que la nucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes, et code pour la GFP afin de permettre l'identification par fluorescence et l'enrichissement des cellules transfectées avec succès. Cette stratégie multi-guide augmente la probabilité d'induire des décalages de cadre ou des délétions produisant un knock-out fonctionnel, offrant ainsi une alternative plus robuste aux approches à guide unique. Les cassures double brin (DSB) induites à plusieurs sites sont résolues par jonction non homologue (NHEJ) ou, lorsqu'elles sont utilisées avec le modèle donneur HDR inclus, par réparation dirigée par homologie (HDR) à un site cible défini au sein du locus.

Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec le donneur HDR exprimant la RFP, les fluorescences GFP et RFP peuvent être utilisées conjointement pour distinguer les populations de cellules transfectées de celles éditées, rationalisant ainsi les workflows de tri par cytométrie en flux et de sélection de clones.

Donneur de réparation dirigée par homologie (HDR) — Cassette de puromycine avec rapporteur RFP

Pour les applications nécessitant des clones knock-out confirmés et sélectionnables, le Gl Syn plasmide HDR (m) comprend une construction donneuse HDR contenant une cassette de résistance à la puromycine (PuroR) et un rapporteur protéine fluorescente rouge (RFP), flanquée de bras d'homologie spécifiques à un site cible Glul défini.
Lorsqu'il est co-transfecté avec le plasmide Gl Syn CRISPR/Cas9 KO (m):

• La cassette PuroR-RFP s'intègre au site de coupure de Cas9 via HDR, perturbant le cadre de lecture ouvert Glul.
  La fluorescence RFP fournit un indicateur visuel immédiat de la réussite de l'intégration, permettant l'identification ou le tri par fluorescence des cellules éditées avant ou parallèlement à la sélection par la puromycine.
  Les cellules éditées avec succès sont confirmées par leur résistance à la puromycine, ce qui réduit considérablement la charge de criblage des clones.
  Cette stratégie de sélection est idéale pour générer des lignées cellulaires KO clonales stables destinées à des études fonctionnelles en aval, au criblage de médicaments ou au développement de modèles.

Système de suppression de la cassette Cre-lox

La construction donneuse HDR comporte des sites loxP flanquant la cassette de sélection PuroR-RFP afin de permettre une suppression propre du marqueur après confirmation du clone. L'expression transitoire de la recombinase Cre via le vecteur Cre inclus Cre Vector: sc-418923 excise la cassette, laissant un site loxP résiduel minimal au sein du locus Glul et éliminant les effets de confusion potentiels sur les tests en aval.
Cette approche en deux étapes :

• Minimise la perturbation de l'architecture locale de la chromatine et des éléments régulateurs voisins
  Restaure un contexte génomique quasi-naturel au niveau du locus édité
  Permet la réutilisation de la stratégie de sélection à la puromycine dans la même lignée cellulaire pour des modifications supplémentaires

Caractéristiques principales

• gRNA ciblant le ou les exons Glul essentiels à la fonction Gl Syn
  Co-expression de SpCas9 et de sgRNA à partir d'un seul plasmide pour une administration simplifiée
  Donneur HDR avec résistance à la puromycine pour une sélection positive des clones
  Cassette PuroR flanquée de loxP avec vecteur de recombinase Cre pour une suppression transparente du marqueur
  Fourni prêt à l'emploi pour une administration par transfection

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.