GFRP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405353-ACT

Das humane Gen **GCHFR** kodiert das GTP-Cyclohydrolase‑I‑Feedback‑Regulationsprotein (GFRP), einen zentralen allosterischen Modulator der GTP-Cyclohydrolase I (GCH1), der die de‑novo‑Biosynthese von Tetrahydrobiopterin (BH4) feinabstimmt. Durch die Integration von Signalen von BH4 und Phenylalanin trägt GFRP zur Aufrechterhaltung der Kofaktor‑Homöostase bei, die die Hydroxylierung aromatischer Aminosäuren und die Aktivität der Stickstoffmonoxid‑Synthasen unterstützt, und beeinflusst damit die Neurotransmitterproduktion sowie redoxsensitive Signalwege. Diese Regulation verknüpft **GCHFR** mit der metabolischen Kontrolle NO‑abhängiger vaskulärer und immunologischer Prozesse sowie mit monoaminergen Biosynthesewegen im Nervensystem. Eine dysregulierte BH4‑Verfügbarkeit und eine veränderte Kontrolle des GCH1–GFRP‑Systems wurden mit Phänotypen in Verbindung gebracht, die für Schmerzsignalgebung, endotheliale Dysfunktion und Neurotransmitter‑Ungleichgewichte relevant sind, wodurch **GCHFR** einen nützlichen Knotenpunkt für pathway‑fokussierte Studien darstellt.

GFRP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GCHFR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GFRP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GCHFR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GCHFR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GFRP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GCHFR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GFRP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GFRP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GCHFR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.