Gephyrin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401197-ACT

O GPHN humano codifica a gephyrina, uma proteína de ancoragem multifuncional que fixa receptores de neurotransmissores inibitórios nas membranas pós-sinápticas e organiza nanodomínios de sinalização essenciais para a transmissão sináptica. A gephyrina liga-se e estabiliza receptores GABA_A e de glicina e interage com componentes do citoesqueleto e do tráfego intracelular para regular o agrupamento de receptores, a maturação das sinapses e a plasticidade. Além do seu papel sináptico, a gephyrina participa da biossíntese do cofator de molibdênio, associando-a à atividade de enzimas redox essenciais e à homeostase metabólica celular. A desregulação da expressão de GPHN ou da organização de receptores dependente de gephyrina tem sido associada a alterações na função de circuitos inibitórios e é relevante para fenótipos relacionados ao neurodesenvolvimento e a crises convulsivas em estudos mecanísticos.

Gephyrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPHN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gephyrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPHN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPHN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gephyrin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPHN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gephyrin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gephyrin em células tumorais com expressão de GPHN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.