Plasmide CRISPR d'Activation (h) Gemin8: sc-404145-ACT

GEMIN8 code pour Gemin8, un composant central du complexe SMN–Gemin, qui soutient l’assemblage des petites ribonucléoprotéines nucléaires spliceosomales (snRNP) requises pour l’épissage du pré-ARNm. Par son rôle dans la biogenèse des snRNP et l’homéostasie du spliceosome, Gemin8 contribue à la fidélité du traitement de l’ARN et, plus largement, à la régulation des programmes d’expression génique. La perturbation de l’activité du complexe SMN est associée à des mécanismes de maladies neuromusculaires et neurodéveloppementales, et peut affecter la viabilité cellulaire et les réponses au stress via une altération du métabolisme de l’ARN. GEMIN8 est donc pertinent pour l’étude des voies associées au spliceosome, de l’assemblage des complexes ARN-protéines et des dérégulations du transcriptome pertinentes pour les maladies dans les cellules humaines.

Gemin8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GEMIN8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Gemin8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GEMIN8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GEMIN8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Gemin8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GEMIN8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Gemin8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Gemin8 dans les cellules tumorales présentant une expression de GEMIN8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.