Plasmide CRISPR d'Activation (h) GCP5: sc-404740-ACT

TUBGCP5 code la protéine 5 du complexe à gamma‑tubuline (GCP5), un composant central du complexe en anneau de la gamma‑tubuline (gamma‑TuRC), qui initie la nucléation des microtubules aux centrosomes et dans d’autres centres organisateurs de microtubules. En soutenant l’assemblage du fuseau mitotique et la fonction du centrosome, GCP5 contribue à une ségrégation fidèle des chromosomes et à la progression de la mitose. La perturbation des sous‑unités du gamma‑TuRC peut dérégler la dynamique des microtubules, entraînant des anomalies des centrosomes et une aneuploïdie, des processus souvent étudiés dans le contexte de l’instabilité du génome et de la biologie tumorale. Des modifications de l’expression ou du nombre de copies de TUBGCP5 ont été rapportées dans des jeux de données associés aux cancers, ce qui en fait une cible pertinente pour étudier les réponses au stress mitotique et les points de contrôle du cycle cellulaire.

GCP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TUBGCP5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GCP5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TUBGCP5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TUBGCP5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GCP5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TUBGCP5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GCP5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GCP5 dans les cellules tumorales présentant une expression de TUBGCP5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.