Plasmide CRISPR d'Activation (h) GAPDH: sc-400002-ACT

Le GAPDH humain code la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, une enzyme centrale de la glycolyse qui catalyse la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en 1,3-bisphosphoglycérate tout en générant du NADH. Au-delà du métabolisme énergétique, le GAPDH participe à l’homéostasie redox, à la liaison aux ARN, au trafic membranaire et à la signalisation sensible au stress, avec des rôles dépendants du contexte dans l’apoptose et l’autophagie. Son expression et sa régulation post-traductionnelle suivent la reprogrammation métabolique et les voies de réponse à l’hypoxie, ce qui le rend pertinent pour l’étude des états prolifératifs, de l’inflammation et des processus neurodégénératifs où le flux glycolytique et le stress oxydatif sont altérés.

GAPDH Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GAPDH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GAPDH Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GAPDH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GAPDH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GAPDH. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GAPDH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GAPDH au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GAPDH dans les cellules tumorales présentant une expression de GAPDH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.