Plásmido CRISPR de Activación (h) G2E3: sc-405720-ACT

El G2E3 humano codifica una ligasa E3 de ubiquitina de tipo RING implicada en la proteostasis dependiente de ubiquitina y en el control del ciclo celular en respuesta al estrés. Al promover la ubiquitinación selectiva de proteínas reguladoras, G2E3 puede influir en la señalización del daño en el ADN, la progresión de los puntos de control (checkpoints) y procesos relacionados con la apoptosis que determinan la supervivencia celular bajo estrés genotóxico o de replicación. La regulación alterada de redes de ligasas de ubiquitina que incluyen a G2E3 se ha asociado con fenotipos de inestabilidad genómica y programas de proliferación desregulados observados en diversos contextos relevantes para enfermedades. Como resultado, G2E3 se estudia con frecuencia por su contribución a la comunicación cruzada entre la señalización por ubiquitina, la dinámica del ciclo celular y las respuestas transcripcionales al estrés celular.

G2E3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de G2E3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

G2E3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus G2E3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional G2E3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de G2E3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo G2E3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de G2E3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía G2E3 en células tumorales con expresión de G2E3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.